OLIGONUCLEOTIDI
ANTISENSO

 

Definizione di oligonucleotide antisenso

· Per oligonucleotide antisenso si intende un breve frammento di DNA, di circa 15 nucleotidi, che contiene la sequenza nucleotidica complementare del filamento di DNA codificante (senso) o di RNA messaggero (mRNA). Perciò l' antisenso, grazie a questa sua "specularità" rispetto al DNA senso, si appaia ad esso, o all' mRNA, annullandone l' attività biologica.

Gli oligonucleotidi di impiego in terapia sono sintetici, ma nelle cellule sono stati individuati anche oligonucleotidi endogeni, di cui è ignota la funzione.

· L’oligonucleotide antisenso si lega all' RNA messaggero, o a sequenze di controllo dell' espressione genica presenti sul filamento complementare di DNA, impedendo così la decodificazione ed il successivo processo di sintesi proteica.

Paul Ehrlich, medico, microbiologo e immunologo vissuto a cavallo tra questo e il secolo scorso, vincitore del premio Nobel nel 1908, sosteneva che nei sieri immuni sviluppati nel corso di una malattia, si vengono a creare "proiettili magici", in grado di neutralizzare specificamente eventuali sostanze ad azione tossica per l' organismo in cui fosse in corso un' infezione.

Le attuali terapie utilizzate nella cura dei tumori sono purtroppo lontane da questo concetto di terapia mirata ed efficace. Esse infatti basano la loro azione su differenze nei processi biochimici o metabolici (come la velocità di crescita) tra cellule normali e tumorali, piuttosto che sulle caratteristiche specifiche della cellula cancerosa. La mancanza di specificità dell' approccio radio- e chemioterapeutico è causa della tossicità generalizzata di queste terapie e rappresenta il principale limite alla loro applicazione.

Un nuovo approccio terapeutico, che sfrutta le conoscenze delle basi molecolari dei tumori, promette di avere quella specificità ed efficacia a cui pensava Ehrlich. Con l' avvento della sintesi chimica degli oligonucleotidi antisenso di DNA, forse si è imboccata la strada della costruzione di "proiettili magici".

Prima di descrivere i potenziali meccanismi di azione a livello farmacologico di queste sostanze, vale forse la pena spendere alcune parole riguardo alle basi biologico/molecolari su cui gli oligonucleotidi, o più semplicemente gli "oligo", dovrebbero o potrebbero svolgere il loro ruolo terapeutico. Allo scopo è opportuno richiamare alla mente alcuni aspetti tipicamente biochimici dell' interazione tra oligonucleotidi antisenso ed RNA o DNA. I due filamenti che compongono la doppia elica del DNA, si appaiano tra loro secondo precise regole di complementarità stereochimiche e termodinamiche: tale appaiamento è noto ai biologi molecolari come legge di Watson e Crick, dai nomi degli scienziati che per primi nel 1953 proposero il modello molecolare della doppia elica del DNA e che valse loro il premio Nobel alcuni anni più tardi.

Le conseguenze dell' appaiamento Watson-Crick sono chiaramente illustrate nella Figura 1. La specificità dell' appaiamento è tale che un oligo lungo da 15 a 18 nucleotidi avrà una sequenza complementare unica nell' intero genoma umano.

 

Figura 1

Il filamento ibrido formato tra RNA messaggero ed oligonucleotide antisenso potrà 1) risultare non utilizzabile dai ribosomi; 2) essere degradato da enzimi; 3) rimanere all’interno del nucleo.

 

Il DNA è comunque di per sè "inerte", in quanto il codice chimico in esso contenuto deve essere prima trascritto in RNA e successivamente tradotto in proteina, affinchè si possa avere la completa espressione di un gene.

Ÿ Come gli oligonucleotidi antisenso potrebbero inserirsi in questa realtà biochimica e quale utilità terapeutica potrebbero avere ?

Ÿ Quale strategia per un impiego clinico ?

 

Esistono due possibilità diverse per un eventuale uso clinico degli oligo antisenso. La prima richiede la formazione di un breve tratto di tripla elica, mediante legami detti di Hogsten, con le regioni di controllo della trascrizione in RNA presenti nel DNA (approccio a tripla elica). Alternativamente si potrebbe pensare di veicolare un oligo antisenso all' interno della cellula per formare una doppia elica ibrida RNA/DNA con il trascritto in RNA. La formazione della molecola ibrida può abolire la capacità di un segmento di DNA ad essere riconosciuto e dunque tradotto dall' apparato cellulare deputato alla biosintesi delle proteine. Entrambe queste strategie sono illustrate in Figura 2.

L’impiego clinico degli oligonucleotidi tuttavia non è privo di problemi.

Uno di questi è rappresentato dalle modalità di trasporto dell’oligo nella cellula da "curare". Questo può risultare relativamente semplice nel trattamento dei linfomi non Hodgkin o delle leucemie, in quanto l'individuo affetto può essere sottoposto a trattamento ex vivo seguito da autotrapianto. Il midollo osseo può essere rimosso dal paziente e le cellule leucemiche separate selettivamente da quelle normali tramite trattamento con oligo rivolti contro i geni associati alla neoplasia. Il midollo osseo ripulito in tal modo può essere infine reimpiantato nell' individuo di origine.

 

L’ approccio ex vivo risulta invece inapplicabile nella cura dei tumori solidi. In questo caso è necessario superare diversi ostacoli: come far giungere l'oligo nel giusto distretto dell' organismo, come far selezionare all'oligo la cellula tumorale rispetto a quella normale. L'oligonucleotide inoltre non deve interferire con i processi biologici che avvengono nella cellula normale.

Una soluzione per il trasporto mirato dell’oligo potrebbe essere quella di coniugare l' oligo ad un anticorpo diretto contro antigeni di superficie specifici per la cellula tumorale.

La stabilità intracellulare è un altro aspetto determinante per l’azione degli oligonucleotidi. E' necessario che la stabilità chimica sia sufficientemente prolungata in modo da garantire un’elevata concentrazione intracellulare del prodotto, evitando che questo venga immediatamente degradato dopo il suo ingresso nella cellula. L'oligo di per sè entra nella cellula con difficoltà in quanto le cariche negative della membrana hanno effetto repulsivo su quelle del fosfato presenti nel DNA. Per facilitare l' ingresso intracellulare e la stabilità dell’oligo sono stati sostuiti alcuni atomi di ossigeno presenti nel DNA con gruppi metilici: questo porterebbe ad una forte diminuzione della repulsione tra le membrane cellulari e l' oligo stesso. Inoltre sono stati anche prodotti oligo in cui l' atomo di fosforo normalmente presente nel DNA viene sostituito da uno di zolfo (S-oligo), allo scopo di aumentarne la solubiltà in soluzione acquosa. Un’alternativa alla trasformazione chimica, potrebbe essere la veicolazione degli oligo terapeutici all' interno della cellula bersaglio dopo inclusione in liposomi.

L’impiego degli oligonucleotidi deve garantire una sicurezza a lungo periodo. Tuttavia, non esistono ancora dati di farmacotossicità derivanti dall' uso prolungato degli oligonucleotidi antisenso.

Non sono note le conseguenze dell' ingresso e della permanenza in un organismo di dosi relativamente massicce di polimeri lunghi almeno 15-17 nucleotidi. Questa dimensione minima dell’oligonucleotide è necessaria se si vogliono evitare interazioni aspecifiche tra l' oligo stesso ed un gene non-target. Inoltre la formazione dell' ibrido RNA/DNA stimola l' attività della ribonucleasi H, un enzima che specificamente opera la demolizione chimica di tali ibridi. Se da un lato questo può accentuare l’attività terapeutica dell' oligo, in quanto oltre all’inibizione della sintesi della proteina si ha anche l’eliminazione dell' RNA corrispondente, dall’altro lato risulta assai difficile prevedere le possibili conseguenze di un aumento di attività della ribonucleasi H a livello intracellulare. Dati ottenuti sia in colture cellulari che in trials clinici, confermano il fatto che la produzione di proteina codificata dal gene target viene ad essere specificamente e drasticamente ridotta dopo l’introduzione dell’oligonucleotide sequenza-specifica.

La strategia a triplice elica, è ancora in una fase estremamente iniziale. Non si è ancora in grado di comprendere appieno quali interazioni di tipo chimico-fisico si verifichino nel corso della formazione della triplice elica tra l' oligo e la doppia elica del DNA.

Per l'uso clinico degli oligo, saranno tuttavia necessari controlli di qualità più accurati per escludere la presenza di contaminanti tossici intrinseci o derivanti dal processo di sintesi.

 

Problemi e soluzioni all' impiego clinico degli oligonucleotidi antisenso

· Presenza a livello intracellulare di enzimi (nucleasi endogene) che degradano il DNA libero in soluzione (e quindi anche gli oligonucleotidi).

L' introduzione di un gruppo metile CH3 o di un atomo di zolfo porta alla formazione di metilfosfonati o metiltioati. Questi derivati sono resistenti all' azione delle nucleasi endogene.

· Selettività di trasporto ed ingresso nelle cellule target. Il problema del trasporto può essere risolto tramite terapia ex vivo nel caso delle leucemie o tramite perfusione in situ nel caso dei tumori solidi. La coniugazione degli oligonucleotidi con anticorpi verso antigeni di superficie faciliterà il targeting verso le cellule neoplastiche.

· Interazione tra oligonucleotide e gene bersaglio. Il requisito di base è la conoscenza della sequenza di DNA di tutto o parte del gene target allo scopo di sintetizzare l' olinucleotide antisenso adatto.