TERAPIA GENICA

I progressi della medicina molecolare in questi ultimi decenni hanno permesso di comprendere molti processi fisiopatologici e le loro relazioni con la struttura, la funzione ed il controllo dei geni, aprendo nuove prospettive alla medicina.Alla fine degli anni 70, l'applicazione della tecnologia del DNA ricombinante ha reso possibile la produzione di sostanze, (insulina umana, interferone, interleuchine, fattori di crescita), che prima dell'avvento di questo metodo produttivo avevano costi elevatissimi o reperibilità ridotta. Agli stessi anni si può far risalire la scoperta dei primi oncogeni che hanno apportato nuove conoscenze riguardo agli aspetti genetici del cancro. La rivoluzione scatenata da questa scoperta è riassumibile in questa frase di Robert A. Weinberg del Massachusetts Institute of Technology (MIT) che affermava nel 1982:

"Nel genoma umano sono presenti geni che, con una lieve alterazione (mutazione puntiforme), diventano agenti capaci di trasformare le cellule e di generare i tumori".

 

L'enorme impulso derivante dall'adozione di strategie biomolecolari ed una migliore comprensione dei fenomeni genetici implicati nell'origine di alcuni tumori, hanno aperto la strada alla terapia genica.La data del 14 settembre 1990 è certamente da considerare una pietra miliare nella storia della terapia genica. Michael Blaese e collaboratori del National Cancer Institute (NCI, Bethesda, USA) condussero il primo esperimento di terapia genica, approvato dal Governo Federale degli Stati Uniti, su una bambina di 4 anni affetta da una grave immunodeficienza, SCID (severe combined immunodeficiency) (Tab-1).

 

Tabella 1

 

I linfociti circolanti della bambina furono prelevati, cresciuti in coltura ed infettati mediante un retrovirus ricombinante, in cui era stato inserito il gene umano dell'adenosin-deaminasi.Successivamente le cellule furono reimpiantate nella paziente (Fig-1).

Figura 1

TERAPIA GENICA "DIRETTA" ED INDIRETTA"

Esistono essenzialmente due approcci in terapia genica:

Una fine strategia genica è rappresentata dalla G-DEPT (gene directed enzyme pro-drug), detta anche "terapia genica suicida".

Due esempi di geni suicidi sono la timidin-chinasi del virus dell'herpes simplex (HSV-TK) e la citosin-deaminasi, che convertono i farmaci non tossici, ganciclovir e 5-fluorocitosina, a prodotti tossici, ganciclovir-trifosfato e 5-fluorouracile, rispettivamente.

Come trapiantare i nuovi geni ?

Uno dei problemi cruciali della terapia genica è come "veicolare" il DNA esogeno all'interno delle cellule.Infatti nei tre miliardi di cellule che compongono l'organismo umano è necessario che il DNA arrivi, o venga pilotato, solo in quelle cellule che richiedono un intervento terapeutico.Un metodo classico per introdurre il DNA all'interno delle cellule è la trasfezione con DNA nudo. Il DNA viene in questo caso mescolato con fosfato di calcio (CaPi) e DEAE destrano e somministrato a cellule in coltura. Tale metodo è semplice ed efficace in vitro. La sua efficienza in vivo è invece discutibile e, forse, la sua applicabilità impossibile (Fig-2).Il CaPi rende la membrana cellulare più fluida, favorendo il processo di endocitosi mediante il quale il DNA entra all'interno della cellula ed è trasportato al nucleo. Il DEAE invece agisce neutralizzando le cariche negative delle fosfoproteine di membrana.

Fig. 2 Modello per il trasporto di CaPi-DNA al nucleo.

La trasfezione è stata tentata anche mediante strategie di tipo fisico, quali la microiniezione che consiste in un’iniezione di una miscela di DNA tramite una micropipetta di vetro sottile posta su un micromanipolatore.Il metodo è laborioso e lento, poichè si può iniettare materiale in una sola cellula alla volta. L’uso di microiniettori compiuterizzati ha ridotto questo inconveniente. La tecnica è attualmente impiegata per inserire DNA esogeno negli embrioni di animali (es. preparazione di topi transgenici) e dunque ha un uso esclusivamente sperimentale.Naturalmente esiste anche un problema di dimensioni. Infatti alcuni tipi di cellule non sono sufficientemente grandi da essere sottoposti a microiniezione.

Altri metodi sono, elettrotrasfezione o trasfezione mediante elettroporazione. L'elettroporazione consiste nel sottoporre una cellula ad un campo elettrico in modo tale da creare pori idrofili nella membrana cellulare. Alcuni ricercatori sostengono però che lo shock elettrico può danneggiare irreversibilmente le cellule e avere perciò effetti collaterali difficilmente valutabili (Fig-3).

Infine ci sono i metodi biologici di trasporto del DNA.La strategia biologica sfrutta le caratteristiche dei virus, cioè la loro capacità di penetrare nelle cellule e di inserirsi nel DNA dell'ospite.Ma non tutti i virus a DNA si sono dimostrati adatti. Anzi spesso il materiale genetico da essi trasportato non si integra nei cromosomi delle cellule infettate. La maggior parte dei virus ad RNA non è adatto al trasferimento dei geni. L'RNA, infatti, non si integra nel DNA delle cellule umane e viene rapidamente degradato. Un'eccezione è fornita dai retrovirus, che adottano una stategia replicativa in cui il loro genoma ad RNA viene retrotrascritto in DNA ed integrato nel genoma della cellula infettata.

I retrovirus inseriscono il loro materiale genetico solo nei cromosomi delle cellule metabolicamente attive e che dunque si duplicano. Alcune cellule, tra cui i neuroni maturi, normalmente non si dividono.Nel cervello dei pazienti affetti da glioma, le uniche cellule proliferanti sono proprio le cellule del glioma. I retrovirus pertanto rappresentano un vettore specifico nel trattamento di questo tipo di neoplasia.Un'interessante protocollo per la terapia genica di questa patologia è stato realizzato da Moolten (1986 e 1990), inserendo in un vettore retrovirale il gene HSV-TK (tirosin-chinasi del virus herpes simplex).Le cellule del glioma, infettate in modo da esprimere il gene HSV-TK, diventavano sensibili ad un analogo dei nucleotidi, il ganciclovir. Dopo somministrazione del farmaco, l'enzima tirosin-chinasi provocava una fosforilazione del ganciclovir, che trasformato in ganciclovir-trifosfato veniva incorporato nel DNA nel corso della replicazione. Il "falso" nucleotide causava successivamente la rottura del filamento del DNA, bloccando di fatto il processo di replicazione e provocando la morte della cellula. Nel corso dei suoi esperimenti Moolten ebbe modo di osservare che anche cellule di glioma non contenenti il gene HSV-TK andavano incontro a morte.

Questo fenomeno è noto come effetto "bystander" o "spettatore".

I retrovirus, tuttavia, presentano alcuni limiti d'applicabilità. Uno dei principali è che l' LTR (long terminal repeat) del retrovirus può promuovere l'espressione di geni adiacenti potenzialmente dannosi per la cellula. Inoltre per impedire la replicazione virale, il vettore deve essere modificato mediante tecniche di ingegneria genetica (Fig-5).

CONCLUSIONI

La terapia genica stà muovendo i suoi primi passi con una celerità impensabile fino a pochi anni fa.Tuttavia l'approccio terapeutico genetico è ancora allo stato embrionale e molte difficoltà dovranno essere superate. Il maggior problema è rappresentato dai sistemi vettore e dalla specificità di espressione.Infine non sono da sottovalutare i potenziali rischi della terapia genica. Il DNA che si integra nel genoma può interrompere geni essenziali per la cellula. Viceversa geni silenti in prossimità del sito di integrazione potrebbero essere attivati.