Il DNA complementare preparato da Mrna può essere espresso nelle cellule ospiti come nel caso di E.Coli. Per formare il cDNA dall’RNA, c’è bisogno di un enzima chiave che è la transrittasi inversa che sintetizza un filamento di DNA da uno stampo di RNA quando viene fornito alla miscela un primer che si accoppia all’RNA e che contiene un gruppo 3’-OH libero (primer oligo dT), l’ibridazione avviene con la sequenza di poliA presente al terminale 3’ della maggior parte degli mRNA degli eucarioti, ovviamente la sintesi procede in presenza dei quattro desossiribonucleotidi trifosfato. Il filamento di RNA di questo ibrido è idrolizzato aumentando il PH mentre il DNA è resistente all’idrolisi alcalina. Il DNA di nuova sintesi presenta un terminale 3’ che forma un ripiegamento che funge da primer per il secondo filamento di DNA, tale ripiegamento viene poi digerito dalla nucleasi S1 che riconosce i nucleotidi non appaiati. Le molecole di cDNA possono essere inseriti in vettori che ne favoriscano l’efficiente espressione in ospiti come E Coli.
METODICA DEL SOUTHERN BLOTTING