PCR (reazione polimerasica a catena)
La PCR è una tecnica che permette di amplificare specifiche sequenze di DNA. Consideriamo una doppia elica di DNA contenente le regioni ABCDE, se le sequenze Be D sono conosciute, si possono ottenere n milioni di copie C usando la PCR.
La miscela per la metodica è data da una copia di primer, i quattro desossiribo nucleotidi trifosfato è una polimerasi termostabile, il ciclo costa di tre fasi:
1-denaturazione del DNA, portando la soluzione alla temperatura di 95 gradi per 15 secondi
2- raffreddamento della soluzione a 54 gradi affinchè ciascun primer ibridizzi con filamento di DNA. Il primer (di solito sono costituiti da un numero di nucleotidi che va da 20 a 30) deve essere presente in largo eccesso in modo che non possa avvenire l’ibridazione tra filamenti parentali.
3- sintesi di DNA, la soluzione viene riscaldata a 72 gradi, temperatura ottimale per la Taq DNA polimerasi che è di tipo termostabile. L’allungamento di entrambi i primer avviene nella soluzione della sequenza a bersaglio. La polimerizzazione viene fatta procedere per 30 secondi di modo che vengano replicati entrambi i filamenti bersaglio.
Le tre fasi vengono eseguite ripetutamente, una importante caratteristica di tale metodica è che tutti i nuovi filamenti di DNA servono da stampo per i cicli successivi e la sequenza bersaglio fiancheggiato dai primer aumenta esponenzialmente mentre le altre sequenze linearmente.
Usi della PCR
In medicina la PCR può offrire importanti informazioni diagnostiche, usando primer specifici si può identificare la presenza di un virus o di batteri, può essere identificata la presenza del virus della immunodeficienza umana (HIV-1) in individui che non hanno ancora espresso una risposta immunitaria contro tale virus.
Si possono identificare mutazioni a carico di alcuni geni per il controllo della crescita cellulare, può essere utilizzata inoltre per stabilire discendenze biologiche.
L’analisi di sangue e di campioni di spermatozoi attraverso la PCR
può fornire informazioni anche in casi di aggressioni e violenze carnali, inoltre tali
metodica permette di ricostruire il DNA da campioni antichi amplificandone i rari
frammenti sopravvissuti.
METODICA DEL SOUTHERN BLOTTING
